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1月4日，新四軍軍部及所屬部隊9000餘人奉命北移，從雲嶺駐地出發繞道前進。6日，行至涇縣境內的丕嶺一帶時，突遭國民黨7個師8萬餘人的包圍襲擊。新四軍被迫抗擊，奮戰7晝夜，終因寡不敵衆，彈盡糧絕，除約2000人突圍外，大部壯烈犧牲或被俘，軍長葉挺被無理扣押，副軍長項英、參謀長周子昆突圍後不幸被叛徒殺害，政治部主任袁國平犧牲。17日，蔣介石竟反誣新四軍“叛變”，宣佈取消其番號，並聲稱要將葉挺交付軍事法庭審判。這就是震驚中外的“皖南事變”。中國共產黨對國民黨這一反動暴行進行了針鋒相對的鬥爭。20日，中共中央革命軍事委員會發布重建新四軍軍部的命令，任命陳毅爲代理軍長，張雲逸爲副軍長，劉少奇爲政治委員，賴傳珠爲參謀長，鄧子恢爲政治部主任。22日，中共中央軍委發言人發表談話，揭露國民黨破壞抗戰，實行反共的陰謀，提出取消17日反動命令，懲辦禍首，釋放葉挺，廢止國民黨一黨專政，實行民主政治等12條解決辦法。以周恩來爲首的南方局，在重慶也展開了猛烈的反擊，揭發和抗議國民黨的暴行。中國共產黨的正義自衛立場得到廣大人民和民主黨派以及國際輿論的同情和支持。宋慶齡、何香凝等聯名打電報斥責蔣介石，指出：今後必須絕對停止以武力攻擊共產黨，必須停止彈壓共產黨的行動。蔣介石集團陷入空前的孤立。28日，新四軍新的軍部在蘇北鹽城成立，並立即根據中共中央指示着手整編部隊，將全軍擴編爲七個師，一個獨立旅。第一師師長粟裕、政治委員劉炎，第二師師長張雲逸(兼)、政治委員鄭位三，第三師師長兼政治委員黃克誠，第四師師長兼政治委員彭雪楓，第五師師長兼政治委員李先念，第六師師長兼政治委員譚震林，第七師師長張鼎丞、政治委員曾希聖，全軍共9萬餘人，繼續堅持長江南北的抗戰。
3月1日，國民參政會第二屆第一次會議在重慶召開。2日，根據中共中央指示，董必武、鄧穎超向國民黨當局提出承認中共和陝甘寧邊區及民主黨派的合法地位、釋放皖南所有被捕幹部戰士等第二個“12條”，作爲共產黨參政員出席國民參政會的條件。6日，蔣介石被迫在會上表示，保證“以後再亦決無剿共的軍事”。8日，董必武被這次會議選舉爲駐會參政員。至此，國民黨頑固派的這一大規模反共活動被打退。
3月，八路軍三五九旅根據中共中央的命令和朱德總司令的指示，開進延安東南荒無人煙但土質肥沃的南泥灣，實行軍墾屯田。12月，中共中央發出“精簡節約”和“生產自救”的指示，要求解放區軍民積極發展生產，保障部隊供給，減輕人民負擔，達到堅持長期抗戰的目的。三五九旅在大生產運動中，成爲全軍的一面旗幟。
5月1日，中央政治局批准《陝甘寧邊區施政綱領》，規定邊區的民意機關和政府中，共產黨員只佔三分之一，黨員必須與黨外人士實行民主合作，不得一意孤行，把持包辦。11月，陝甘寧邊區召開第二屆參議會第一次會議，選舉的常駐議員和政府委員中，共產黨員只佔三分之一。開明紳士李鼎銘被選爲陝甘寧邊區政府副主席。
5月13日，中共中央決定，原中央西北工作委員會與陝甘寧邊區中央局合併成立中共中央西北局，以高崗、王世泰、張邦英、林伯渠、謝覺哉、陳正人、蕭勁光爲委員，賈拓夫、李卓然爲候補委員，高崗爲書記。
5月19日，毛澤東在延安幹部會議上作《改造我們的學習》的報告，深刻地批判了主觀主義的惡劣作風，號召全黨樹立理論和實際相統一的實事求是的馬克思主義作風。7月1日，中共中央作出《關於增強黨性的決定》。8月1日，又作出《關於調查研究的決定》。9月10日至10月22日，中共中央政治局舉行擴大會議，討論了黨的歷史上、特別是土地革命戰爭時期的路線問題，確認在土地革命戰爭後期，王明、博古等人領導的黨中央所犯的“左”傾錯誤是“路線錯誤”。一些受王明影響而犯過錯誤的同志作了自我批評。會議決定在全黨發動思想革命，反對主觀主義和宗派主義。9月26日，中共中央決定成立學習研究組，毛澤東任組長，王稼祥任副組長，主要任務是研究馬克思列寧主義理論和黨的歷史經驗，以克服主觀主義和形式主義等錯誤思想。同時決定成立各地高級學習組，組織高級幹部學習。
5月20日，根據中共中央決定，中共中央東南局與中共中央中原局合併，正式成立中共中央華中局，同時成立華中軍分會。中共中央華中局由劉少奇、饒漱石、曾山、陳毅、鄧子恢、張雲逸、鄭位三、郭樹勳、彭雪楓、黃克誠、張鼎丞、譚震林、劉英等組成，劉少奇任書記，饒漱石任副書記。華中軍分會由劉少奇、陳毅、張雲逸、鄧子恢、饒漱石、賴傳珠、羅炳輝、劉炎、粟裕、黃克誠、彭雪楓、李先念、張鼎丞、譚震林、曾希聖、傅秋濤、彭明治、譚希林、葉飛、周駿鳴、張愛萍、鄭位三等組成，劉少奇兼書記，陳毅、鄧子恢、賴傳珠、張雲逸、黃克誠、饒漱石、劉炎爲常委。
6月22日，德國法西斯向蘇聯發動侵略戰爭。日本帝國主義爲配合德國在歐洲的進攻，把中國變成它擴大侵略戰爭的“後方基地”，加緊了對解放區，特別是對華北解放區的“打蕩”和“蠶食”，大搞“治安強化運動”，同時對國民黨繼續採取誘降的方針。在日軍、僞軍和頑固派軍隊的夾攻和封鎖之下，敵後解放區進入了空前困難的時期，人民抗日武裝的人數和抗日根據地的面積和人口都逐漸縮小。從7月到11月，日、僞軍分別對晉察冀、晉冀豫、冀魯豫、山東和蘇北、蘇中、蘇南等根據地大規模地進行“掃蕩”和“蠶食”。根據地軍民創造了地道戰、地雷戰、麻雀戰、破襲戰、圍困戰等多種武裝鬥爭形式，充分發揮了人民戰爭的威力，有效地打擊了日軍。同時，又派出大批武裝工作隊深入敵佔區，實行敵進我進，發動羣衆，積極巧妙地打擊敵人，打破敵人的“治安強化運動”。
9月25日，日軍3500人瘋狂進攻河北易縣八路軍部隊。晉察冀軍區一分區一團七連六班班長馬寶玉和戰士胡德林、胡福纔等5人，爲了掩護主力轉移到外線作戰，並使羣衆轉移到安全地帶，主動把敵人吸引到狼牙山的懸崖絕壁，據險抵抗，子彈打光了，就用石頭砸，最後寧死不屈，毅然砸槍跳崖，3人壯烈犧牲，2人負傷倖存。這一壯舉，表現了共產黨領導的人民軍隊的高尚品質和中華民族不可征服的英雄氣概。
11月7日，中共中央革命軍事委員會發出《關於抗日根據地軍事建設的指示》。文件指出，在新形勢下，敵後鬥爭方針是堅持長期分散的游擊戰爭，採取各種鬥爭方式與敵周旋，節省和保存自己的實力。並規定人民武裝力量體制應包含主力軍、地方軍和羣衆武裝(即不脫離生產的自衛隊和民兵)三部分。目前，應以擴大、鞏固地方軍和羣衆武裝爲中心，主力軍採取適當的精兵主義。這樣，就完善了三位一體的人民戰爭的軍事體制，使游擊戰爭得以空前廣泛地開展起來。
12月8日，由於日本法西斯在太平洋上對美、英發動突然襲擊，美國和英國對日宣戰，太平洋戰爭爆發。9日，中國共產黨爲太平洋戰爭發表宣言指出，全世界劃分爲舉行侵略戰爭的法西斯陣線與舉行解放戰爭的反法西斯陣線已經最後地明朗了。同日，中國政府正式對日宣戰，同時對德、意宣戰。太平洋戰爭的爆發，使第二次世界大戰發展到最大規模，中國與各同盟國的作戰匯成一體。
12月17日，中共中央發出《關於太平洋戰爭爆發後抗日根據地工作的指示》，號召全黨全軍實行“精兵簡政”，要求切實整頓各級組織機構，精簡機關，充實連隊，加強基層，提高效能，節約人力物力，反對官僚主義。“精兵簡政”是克服根據地日益縮小、財政經濟嚴重困難和生息民力的一項極其重要的政策。
12月至次年1月，中共中央南方局在重慶舉行會議，總結兩年來的工作。周恩來在會上發表講話，根據中共中央關於在國民黨統治區實行“長期埋伏、積蓄力量、等待時機”的正確方針，要求把西南的黨建設成爲更加堅強、更能戰鬥的黨，指出黨的領導機關要熟悉國民黨統治區各方面的情況，善於估計形勢，運用策略，創造各種各樣的工作方法，使上層工作和下層工作、公開工作和祕密工作、黨外的聯繫和黨內的聯繫相互配合(不是暴露)。稍後，針對國民黨的高壓政策和部分黨員缺乏工作信心的情況，周恩來提出了勤業、勤學、勤交友三項任務。以周恩來爲首的南方局對各民主黨派、文化教育界人士、民族工商業者以及國民黨內的民主派和地方實力派，進行了大量卓有成效的統一戰線工作；領導《新華日報》等報刊，在極其艱難的條件下，宣傳共產黨的方針政策，爭取中間力量，推動國民黨統治區民主運動的發展；建設西南地區中共組織，保存和發展國民黨統治區的黨的力量。中共中央南方局的工作提高了共產黨的政治威望，孤立了國民黨頑固派，爲堅持全民族抗戰和配合敵後解放區戰場的鬥爭，作出了貢獻。
1941年，日軍爲了鞏固其佔領區，對國民黨正面戰場發動一些小規模的進攻戰役。1月發動豫南戰役，3月發動上高戰役，5月發動晉南戰役，9月發動第二次長沙戰役，12月發動第三次長沙戰役。在這些戰役中，國民黨軍隊進行了抵抗，日軍未能取得大規模的推進。國民黨正面戰場牽制了一部分日本侵略軍，對解放區戰場的反“打蕩”和“反“蠶食”鬥爭起了配合作用。
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