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新四軍成立並集中後，根據中共中央和毛澤東關於建立根據地，擴大新四軍基地的指示，新四軍各支隊迅速向敵後挺進。1938年4月底，第四支隊展開於皖中敵後的舒城、桐城、廬江、無爲和巢縣地區。5月12日，第四支隊先頭部隊取得蔣家河口戰鬥的勝利。4月下旬，軍部組織先遣支隊，在粟裕率領下，挺進蘇南敵後執行戰略偵察任務，6月17日取得韋崗戰鬥的勝利。陳毅即興賦詩祝賀：“彎弓射日到江南，終夜喧呼敵膽寒。鎮江城下初遭遇，脫手斬得小樓蘭。”6月至7月，第一、第二支隊相繼進入江南敵後鎮江、句容、丹陽、金壇和江寧、溧水、高淳等地區，創建以茅山爲中心的蘇南抗日根據地。第三支隊在策應第一、第二支隊挺進蘇南後，即進抵皖南抗日前線，展開對敵作戰。10月，成立新四軍遊擊支隊(後改編爲第六支隊)，開闢豫皖蘇邊抗日根據地。
1939年1月，新四軍豫鄂獨立遊擊支隊(後整編爲豫鄂挺進縱隊)向武漢外圍挺進，深入豫南、鄂東、鄂中敵後，開闢鄂豫邊根據地。2月，中央軍委副主席周恩來到皖南，商定新四軍向南鞏固、向東作戰、向北發展的戰略任務。5月，新四軍江北指揮部成立後，整編第四支隊，組建第五支隊，展開於淮南津浦鐵路兩側地區。新四軍遊擊支隊會同八路軍蘇魯豫支隊、隴海南進支隊，開闢了豫皖蘇邊、蘇皖邊等根據地。11月，新四軍江南指揮部成立，統一領導蘇南部隊。與此同時，中共中央中原局書記劉少奇抵達華中敵後，爲貫徹執行中共中央發展華中的戰略方針，接連主持召開了中原局會議，決定了向西防禦、向東發展、開闢蘇北的方針和普遍建立根據地的任務，使華中抗日根據地的建設進入一個新的發展時期。
1940年5月，八路軍第二縱隊主力南下華中，後與新四軍第六支隊合編爲八路軍第四、第五縱隊。第五縱隊隨即東進淮海地區。7月，新四軍江南指揮部率主力北渡長江，組建蘇北指揮部，於10月取得黃橋自衛戰勝利後，在鹽城、東臺間的白駒鎮與八路軍第五縱隊一部會師，合力開闢蘇北、蘇中根據地。11月，成立華中新四軍八路軍總指揮部，葉挺、陳毅分任正、副總指揮，劉少奇任政治委員，統一領導華中新四軍和八路軍。在中原局、東南局領導下，華中抗日根據地軍民同日僞軍進行頑強戰鬥，至1940年底，先後建立了蘇南、皖東、豫皖蘇邊、蘇皖邊、蘇北、鄂豫邊等根據地，面積達到4. 4萬餘平方公里，人口1470餘萬，新四軍主力部隊發展到8.8萬餘人。新四軍挺進大江南北，開展獨立自主的游擊戰爭，建立敵後抗日根據地，開闢了華中敵後戰場。華中抗日根據地的創建和發展，使新四軍有了基本的陣地和可靠的後方。
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